Hemocytometer 사용법

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http://biotakorea.blogspot.com/2010/03/hemocytometer.html

혈구계(Hemocytometer 또는 Haemocytometer)는 원래 혈구세포를 세기 위해 고안되었지만 현재 현미경상으로 볼 수 있는 대부분의 입자들을 세는데 사용되고 있다(예, 정자등의 세포수 계수, 플랑크톤 계수 등)



Hemocytometer는 Louis-Charles Malassez가 고안한 것으로 챔버를 가진 사각형의 두꺼운 유리 슬라이드 글라스로 만들어 져있다. 이 챔버에는 현미경으로 관찰 할 수 있는 미세한 격자가 레이저로 조각되어 있다. 혈구계는 이 챔버의 두께와 격자의 면적을 이용하여 일정 용량내의 세포 또는 입자를 계수한 후 희석배율등을 고려하여 전체 용액내의 세포, 입자수를 계산할 수 있다. 

잘 섞여진 샘플용액에서 마이크로 피펫을 이용하여 적당량(약 50ul정도?)을 혈구계의 주입구로 주입한다. 

혈구계의 슬라이드글라스와 커버글라스내에는 일정량의 용량만 수용할 수 있도록 고안되어 있으므로 조금 로딩하여 기다리면 

모세관 현상에 의해 빨려들어간 후 전체적으로 잘 펴지게 된다. (만일 운동성이 있는 샘플이라면 사전에 포르말린 등을 처리.....)

<혈구계 단면도>

혈구계내의 격자(Grid)의 구성, 격자의 부피(Voulume)



Hemocytometer grid: red square = 1 mm^2, 100 nl green square = 0.0625 mm^2, 6.25 nl yellow square = 0.04 mm^2, 4 nl blue square = 0.0025 mm^2, 0.25 nl at a depth of 0.1 mm.



각각의 격자내에 있는 입자수를 편의에 따라 계수한 후 다음 식에 따라 원래 용액 내의 입자의 밀도를 구한다. 



원래용액속의 입자밀도=(계수된 입자의 수/(계수한 챔버의 proportion)X(샘플을 희석한부피/원래샘플의 부피)


원리는 이러하지만.....보통의 경우 일반적으로 편리하게 아래의 방법을 이용하여 사용한다. 

아래그림에서 제일 큰 사각형의 네 귀퉁이를 차지하는 사각형 내의 셀수를 계수한다. 

계수하는 이 사각형의 면적은 1mm^2이다.


4개의 사각형에 들어있는 입자의 수를 모두 계수한 다음 평균을 구한 다음 1ml당 개체수로 환산하기 위해 104을 곱하여준다. 



예)
사각형 1---> 56, 사각형 2---> 65, 사각형 3---> 49. 사각형 4---->59개의 입자가 계수되었다면 

이들의 평균은 57.3이고 이것은 1mm2 x0.1mm=0.1mm^3의 부피내에 들어있는 입자의 수가 평균 갯수가 될 것이다. 
1ml=1cm^3(1000mm^3)이므로, 1ml당 입자의 수를 구하기 위해 104을 곱하여주면 된다.